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Le site du domaine national de Chambord repose essentiellement sur des sols sableux ou argileux. La rivière du Cosson, en creusant son lit, a permis l’émergence du calcaire de Beauce dans le sous-sol de la forêt, à l’ouest du massif. Dans le même temps, une partie des basses alluvions de la Loire est venue recouvrir les sables et argiles de Sologne, au nord-ouest du parc.
En termes de flore, l'intérêt du site est assez diffus : l'ensemble est majoritairement recouvert de chênaies acidiphiles et de plantations de pins gérées par le Domaine national de Chambord. Les zones remarquables s'observent surtout sur les layons forestiers et les plans d'eau où ont pu être observés 13 habitats déterminants de ZNIEFF, en des états de conservation plus ou moins bons. La cartographie du site dans le cadre de Natura 2000 a ainsi pu mettre en évidence 46 hectares de lande fraîche à Bruyère à balais, 1.84 hectares de végétation rase vivace des bords exondés de mares et d'étangs ou 1.76 hectares de prairie humide oligotrophe acidiphile à Jonc acutiflore. L'ensemble des habitats d'intérêt communautaire ne représente que 1% du site.
De nombreuses espèces rares sont mentionnées à l'intérieur du contour comme le Rhynchospore blanc (Rhynchospora alba), le Rubanier nain (Sparganium minimum - seule station du Loir-et-Cher) ou le Flûteau nageant (Luronium natans). Mentionnons également les très belles populations de Glaïeul d'Illyrie (Gladiolus illyricus) en compagnie de la Gentiane pneumonanthe (Gentiana pneumonanthe) surtout présentes au nord du site.
Au total, 75 plantes déterminantes, dont 25 protégées, ont été observées sur le domaine de Chambord entre 1990 et 2011. Ce site est donc classé en ZNIEFF de type II pour la richesse en espèces et habitats patrimoniaux qui y est répartie de manière sporadique sur son ensemble.
Concernant la faune, on peut noter la présence de six à sept couples nicheurs de Balbuzard pêcheur, ainsi que la présence de nombreux autres rapaces. Cette ZNIEFF accueille également trois espèces déterminantes de coléoptères et quelques espèces très rares comme (Coroebus undatus). Les mares du site abritent une bonne diversité d'amphibiens (dont deux déterminants de ZNIEFF) et de libellules (dont la très rare Leucorrhine à gros thorax). A noter que le château de Chambord constitue la plus importante colonie de mise bas de Sologne connue pour le Grand Murin (Myotis myotis), avec plusieurs centaines de femelles comptabilisées.
Le contour reprend globalement celui de la zone spéciale de conservation (ZSC) à l’exception de l'étang de Montperché au sud-est, qui n'est pas inclus à la ZNIEFF, car déconnecté du domaine de Chambord. A l'inverse, 3 parties du domaine de Chambord, à l'extérieure du site Natura 2000, sont incluses à la ZNIEFF :
- la partie ouverte au public au nord-ouest car elle présente les mêmes conditions écologiques que le reste du domaine ;
- le château en lui même pour l'intérêt chiroptèrologique qu'il renferme ;
- les prairies du Cosson à l'ouest du site.
