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La grotte de Tréfiez est d'un grand intérêt pour les chauves-souris. Ni chauves (car très poilues), ni souris (car possédant une dentition complète d’insectivore), les chauves-souris constituent l’un des groupes de vertébrés les plus remarquables. En effet, elles sont les seuls mammifères à avoir acquis la maîtrise du vol actif. Elles ont aussi la particularité de "voir avec les oreilles" : même si leurs yeux sont fonctionnels, ces animaux nocturnes utilisent un sonar. Les ultrasons sont produits par la bouche ou le nez de l’animal. Ensuite, grâce à ses oreilles, ce dernier capte l’écho du son qui a été réfléchi par les obstacles ou les proies. La Barbastelle, en particulier, a été observée en 1998 en hivernage dans la grotte de Tréfiez. C’est une chauve-souris de taille moyenne (4,5 à 6 cm pour le corps plus la tête), au pelage assez noir. Ses oreilles sont caractéristiques, assez grandes, de forme presque géométrique (carrée). Elles sont jointes à leur base, vers les yeux, à la naissance du museau qui est très court et épaté comme celui d’un bouledogue. Cette espèce résiste assez bien au froid. En 1997, le seul site de reproduction connu en région Rhône-Alpes pour cette espèce se trouvait dans l'Ain. Les chauves-souris sont quasiment toutes menacées sur le territoire français à cause des dérangements, de la disparition de leur gîtes et de l’utilisation massive de pesticides. Pourtant, la sauvegarde de ces animaux apparus il y a environ cinquante millions d’années devrait être une priorité.
